Genom düzenlenme teknolojisiyle periferal kan mononüklear hücrelerde transforme edici büyüme faktor beta ile indüklenen gende Arg124Cys mutasyonunun oluşturulması

CRISPR/Cas9 (düzenli aralıklarla bölünmüş kısa palindromik tekrar kümeleri/CRISPR- ilişkili nükleaz-9) sistemi birçok bakteri ve arkelerde bulunan, plazmit ve bakteriofaj gibi yabancı genetik elementlere karşı edinilmiş RNA rehberli bir genom savunma sistemi olarak keşfedilmiş ve mühendislik yaklaşımlarıyla genom düzenleme aracı olarak kullanıma girmiş bir teknolojidir. Bu teknoloji, gen dizilerinin düzeltilmesinde yani gen tedavisi, gen işlevlerinin çalışılması, transgenik hayvan ve hücre modellerinin oluşturulması, protein kodlamayan DNA bölgelerinin işlevlerinin araştırılması, hastalık modellemesi, genetik tarama, epigenom düzenleme, hücre etiketleme, gibi çeşitli araştırma amaçları için uygulanmaktadır. Transforming growth factor beta-induced (TGFBI) geni, hücre dışı matriks elemanı olan TGFBI proteinini kodlamaktadır. TGFBI proteini kalp, karaciğer, pankreas, deri, kemik, tendon, böbrek, kan plazması, göz gibi vücudun çeşitli organlarında yüksek düzeyde ifade edilmektedir. TGFBI proteinin hücresel adezyon, göç, proliferasyon ve farklılaşma gibi süreçlere aracılık ederek fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. TGFBI proteininin, korneanın şeffaflığının sağlanması ve sürdürülmesinde temel olan stromal matriksin organizasyonunun ve mimarisinin korunmasında önemli rol oynadığı ve bu gendeki mutasyonların farklı tipde kornea distrofilerine yol açtığı bilinmektedir. Ancak primer kornea hücrelerinin eldesinde ve kültürüzasyonundaki güçlükler nedeniyle kornea epitel hücrelerinin kimliklendirilmesi, biyolojisi, hücresel mekanizmaları ve bunların hastalık patogenezlerindeki rolleri anlaşılamamakta ve etkin ilaç deneme çalışmaları yapılamamaktadır. Çalışmamızda CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak, insan periferal kan mononüklear hücre (peripheral blood mononuclear cell; PBMC)'lerinde TGFBI geninin ekzon 4 bölgesinde lokalize, Arg124Cys (R124C) mutasyonunun oluşturulması hedeflendi. Bu amaçla öncelikle sağlıklı gönüllü bireylerden PBMC eldesi ve uzun sureli kültürüzasyonunun yapılabilmesi, hedef bölgeye yönelik tasarlanan gRNA'ların klonlanması, PBMC hücrelerine elektroporasyon yöntemiyle aktarılması ve PBMC hücrelerinde hedef mutasyonun oluşumunun gerçekleştirilmesi ve DNA dizi analizi yöntemiyle sonuçların doğrulanması planlandı. Çalışma sonuçlarımız ile kolay ulaşılabilir PBMC'lerde CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanarak TGFBI geninin ekzon 4 bölgesinde Arg124Cys mutasyonu oluşturulması hedefine ulaşılması ile, ileride kornea hücrelerinde mutasyon oluşumu, kornea hücrelerinde hastalığın modellenebilmesi, farklı tipde korneal distrofilerin mekanizmanın anlaşılması ve tedavi yaklaşımlarına yönelik çalışmaların yapılabilmesine olanak sağlayabilecek çalışmalarımıza önemli bir zemin hazırlanmış olacaktır. Aynı zamanda elde edilen sonuçlar diğer kalıtsal hastalıklar ve çeşitli kanserlerin modellenmesi çalışmalarına da ışık tutacaktır.